Expressão gênica diferencial em resposta aos efeitos da proteína anti-inflamatória Anexina A1 nas células epiteliais pigmentadas da retina humana

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Laila Toniol Cardin
Expressão Gênica Diferencial em resposta aos efeitos da proteína anti-inflamatória Anexina A1 nas células epiteliais pigmentadas da
retina humana
_____________________________________________________ São José do Rio Preto 2013

Laila Toniol Cardin
Expressão Gênica Diferencial em resposta aos efeitos da proteína anti-inflamatória Anexina A1 nas células epiteliais pigmentadas da
retina humana
Dissertação apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Genética, junto ao Programa de Pós-graduação em Genética, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de São José do Rio Preto. Orientadora: Profa. Dra. Flávia Cristina Rodrigues Lisoni Co-orientadora: Profa. Dra. Sonia Maria Oliani
São José do Rio Preto 2013

Cardin, Laila Toniol. Expressão diferencial em resposta aos efeitos da proteína anti-
inflamatória Anexina A1 nas células epiteliais pigmentadas da retina humana / Laila Toniol Cardin. – São José do Rio Preto: [s.n.], 2013.
f.102 : il. , 30 cm.
Orientadora: Flávia Cristina Rodrigues Lisoni Co-orientador: Sonia Maria Oliani Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas
1. Inflamação ocular. 2. Anexina A1. 3. Expressão gênica. 4. Cultura de Células. I. Rodrigues-Lisoni, Flávia Cristina. II. Oliani, Sonia Maria. III. Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas. IV. Título.
CDU – 577.112
Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca do IBILCE Campus de São José do Rio Preto – UNESP

Laila Toniol Cardin
Expressão Gênica Diferencial em resposta aos efeitos da proteína anti-inflamatória Anexina A1 nas células epiteliais pigmentadas da
retina humana
Dissertação apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Genética, junto ao Programa de Pós-graduação em Genética, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de São José do Rio Preto.
Banca Examinadora
Profa. Dra. Flávia Cristina Rodrigues Lisoni UNESP – Ilha Solteira Orientadora
Profa. Dra. Érika Cristina Pavarino FAMERP – São José do Rio Preto
Profa. Dra. Claúdia Marcia Aparecida Carareto UNESP – São José do Rio Preto
Profa. Dra. Eny Maria Goloni Bertollo FAMERP – São José do Rio Preto
Profa. Dra. Cristiane Damas Gil UNIFESP – São Paulo
São José do Rio Preto 25 de fevereiro de 2013

DEDICATÓRIA
À minha família, meus pais, José e Maria, e irmãos, Juciene e Pedro, que são meu porto seguro, me ouvindo e aconselhando quando eu não tinha mais esperanças, e meus exemplos
de vida, cada um com sua personalidade e dificuldades do dia-a-dia me ensinaram e, são os colaboradores da minha jornada e das minhas conquistas.

À minha orientadora, Profª Drª Flávia Cristina Rodrigues Lisoni, pelos ensinamentos, pela amizade, paciência, dedicação de sempre se fazer presente apesar da distância e buscar fornecer as melhores condições para realização do Mestrado. Por ser essa pessoa maravilhosa
que me acolheu na sua vida profissional e pessoal.

À minha co-orientadora, Profª Drª Sonia Maria Oliani, meu respeito e reconhecimento pela assistência e brilhantismo profissional. Muito obrigada pela oportunidade e confiança, é exemplo de Mestre por quem tenho e terei sempre imensa admiração.

AGRADECIMENTOS
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela bolsa concedida de Mestrado.
Ao Programa e Professores da Pós-graduação em Genética, por possibilitar a realização do meu Mestrado e pelo conhecimento adquirido.
Aos funcionários da Seção de Pós-graduação pela competência e colaboração na resolução de diversos problemas.
Ao Departamento de Biologia do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas de São José do Rio Preto, pela atenção e colaboração quando precisei.
À Profa. Dra. Eloiza Tajara, coordenadora do Laboratório de Marcadores Moleculares e Bioinformática Médica, da Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto, pelos recursos oferecidos, dos equipamentos e materiais, para realização das técnicas.
À aluna de doutorado Bianca da Cunha Rodrigues, Dra. Fernanda Carregaro e ao técnico Tiago Henrique pelo auxiliou prestado no desenvolvimento de técnicas, e pela paciência e solicitude.
Ao Prof. Dr. Wilson Araújo da Silva Junior, da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, por me receber em seu laboratório e pelos recursos, equipamentos e materiais oferecidos para realização da Técnica de Hibridização Subtrativa Rápida.
A Auxiliar de Pesquisa Científica e Tecnológica Anemari Ramos Dinarte dos Santos, da Fundação Hemocentro de Ribeirão Preto, pelo ensino da Técnica de Hibridização Subtrativa Rápida, pela acolhida e amizade. E a todos do Hemocentro de Ribeirão Preto que contribuíram com esse trabalho e me receberam tão amigavelmente.
À Profa. Dra. Paula Rahal, coordenadora do laboratório GENOMA, do de Biociências, Letras e Ciências Exatas de São José do Rio Preto, por disponibilizar seu laboratório e recurso para realização desse trabalho.

À aluna de doutorado Marina Curado Valsechi, por me auxiliar com os géis de agarose e realização de PCR e ser sempre solícita.
À Profa. Dra. Andréia Machado Leopoldino, da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, e sua aluna Laís Sobral, pelo auxílio prestado na realização da técnica de migração celular.
À Profa. Dra. Claudia Carareto, coordenadora do Laboratório de Evolução Molecular de insetos, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas de São José do Rio Preto, por disponibilizar seu laboratório e recurso para realização desse trabalho.
À Dra. Adriana Granzotto, pelo auxilio, técnico e científico, no laboratório, e especialmente pela convivência no dia-a-dia, companheira de apartamento, agradeço pela paciência, amizade, disponibilidade, apoio, conversas, conselhos, enfim, por tudo que me ajudou e melhorou os meus dias, nessa primeira experiência longe de minha família.
Aos valiosos companheiros do Laboratório de Imunomorfologia do IBILCE, Alexandre Dantas Gimenes, Aline Camargo Miranda, Ayla Blanco Poltronieri, Caroline de Freitas Zanon, Claudia de Mello Bosnich, Cristiane Damas Gil, Gabriela Franco Bueno, Janesly Prates, Jéssica Zani Lacerda, Kallyne Kioko Mimura, Marina de Paula Silva, Marystela Fávero Oliveira, Poatan da Silva Pinoti, Rafaela Molás, uma equipe a qual é exemplo de trabalho com alegria e entusiasmo, pelos momentos de alegria e companheirismo.
Às queridas amigas Ana Paula Girol, Carla Patrícia Carlos e Thaís Santana Gastardelo, exemplos de pessoas, por me ajudar durante o Mestrado, estando sempre prontas e dispostas.
À Analice Andreoli, pessoa atenciosa e convicta, pelo seu companheirismo e apoio nos momentos de angustia, pela sua amizade e carinho em todos os outros momentos de minha vida, por me entender, aceitar, pelas conversas e por todo crescimento que me proporcionou desde que conheci.
Aos maravilhosos amigos Nathália Martins Sonehara e Rubens de Paula Junior, pessoas atenciosas, carinhosas, solicitas. Agradeço pela companhia na minha vida profissional

e pessoal, cada um com seu jeito, obrigada por essa amizade sincera, que ultrapassou os percalços do caminho e me proporcionou um crescimento pessoal inigualável nesses dois anos de convivência. E também por todo auxilio, generosidade, paciência, compreensão, aceitação e companheirismo concedidos nessa primeira aventura longe da minha família.
À todos os companheiros da Pós-graduação em Genética, e em especial a Bruna Victorasso Jardim, Gabriela Bottaro Gelaleti, Marcela Alcântara Proença, Maysa Succi.
Aos meus tios Iasmara e Valdir, e primas Ana Laura e Maria Claúdia, pela acolhida nos primeiros meses, e pela solicitude em qualquer momento. Obrigada por estarem comigo me ajudando sempre que eu precisei.
Ao pessoal da Equipe de jovens de Nossa Senhora, pela companhia nos eventos das equipes, em especial à Bianca Mendicino, Débora Cristina dos Santos, Geovane Prates Ferreira, Grazielle Gouveia e Laís Ramires Mendicino, pela companhia em vários momentos e pela amizade.
Às minhas amigas Letícia Rodrigues, Lorraine Stefanini, Pâmela Figueiredo, Talita Rossini e Valquiria Lima, pela amizade sincera, por se fazerem presentes mesmo a distância, pessoas importantes no conjunto que cerca minha vida, pelo apoio e incentivo constantes, amo demais.
E acima de tudo eu agradeço a Deus por ter me concedido a vida, e em todos os momentos está ao meu lado me protegendo, guiando e confortando, me ajudando a passar por todas as fases, sejam elas boas ou ruins.

“Todo mundo é um gênio. Mas, se você julgar um peixe pela sua capacidade de subir em uma árvore, ele vai gastar toda uma vida acreditando que é estúpido.” Albert Einstein

RESUMO
INTRODUÇÃO: A inflamação é caracterizada pelo acúmulo de leucócitos nos tecidos oculares, podendo afetar qualquer parte do olho, sendo um processo doloroso, associado à fotofobia e podendo resultar em complicações secundárias. Em geral, no tratamento dessas inflamações intra-oculares, os glicocorticóides são os medicamentos freqüentemente administrados. Porém, devido aos efeitos adversos, existe uma demanda óbvia para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas. Entre elas, a proteína anexina A1 (ANXA1) tem mostrado a sua participação ativa nos processos inflamatórios. OBJETIVO: Em função desses dados, foi realizado o presente trabalho que teve como objetivo geral avaliar a influência desse tratamento anti-inflamatório nas células epiteliais pigmentadas da retina humana (ARPE-19), sobre a morfologia, proliferação, migração e na expressão gênica e proteica. MATERIAL E MÉTODOS: As células ARPE-19 foram cultivadas em meio completo e estimuladas pelo Lipopolissacarideo bacteriano (LPS), e em outro experimento foi acrescentado o tratamento com o peptídeo ANXA1Ac2-26, para avaliar o possível efeito anti-inflamatório dessa proteína, nos tempos de 1, 2, 4, 24, 48 e 72 horas sobre a morfologia, proliferação e migração celular. Após análises estatísticas, que evidenciaram o tempo de 72 horas, foi realizado um novo cultivo celular para a extração do RNA e conduzida a técnica de Hibridização Subtrativa Rápida (RaSH). A validação de cinco genes encontrados como diferencialmente expressos foi realizada por RT-qPCR. Além dessas técnicas, também foi analisada a expressão das citocinas anti e pró-inflamatórias pelo ensaio Multiplex. RESULTADOS: O ANXA1Ac2-26 não modificou a morfologia das células ARPE-19, entretanto diminui a proliferação e aumenta a migração celular. Pela tecnologia de RaSH foram encontrados 80 genes diferencialmente expressos após o tratamento com ANXA1Ac2-26. Cinco desses genes (LRAT, CTGF, MAP1B, ALDH1A3 e SETD7), devido às suas funções estarem relacionadas com doenças oculares e/ou inflamatórias, foram validados por RT-qPCR, mas apenas dois deles (LRAT, CTGF) confirmaram a baixa expressão. Também foram interligadas as vias de sinalização celular, das quais a ANXA1 participa, importantes para o processo inflamatório, pelo Ingenuity Sistems©. Em relação à análise da expressão das citocinas, observou-se que o tratamento com ANXA1Ac2-26 diminuiu a expressão de moléculas pró-inflamatórias, na

concentração de 100 µg/ml. CONCLUSÃO: As nossas analises in vitro mostram que a proteína ANXA1 pode interagir nas cascatas de sinalização de processos inflamatórios, alterando a proliferação, migração e expressão gênica e proteica nas células. Desse modo, os nossos resultados apontam que as Células do Epitélio Pigmentado da Retina (EPR) são um alvo potencial da atividade da proteína ANXA1, tendo em vista sua possível utilização em terapias inovadoras no tratamento de inflamações oculares.
Palavras-chave: Anexina A1, Inflamação ocular, Cultura de células, RaSH, Expressão gênica.

ABSTRACT
INTRODUCTION: The inflammation is characterized by the accumulation of leukocytes in ocular tissues, and it can affect any part of the eye, been a painful process, associated with photophobia and may result in secondary complications. In general, for the treatment of these intraocular inflammations, the glucocorticoids are the drugs frequently administered. However, due to its side effects, there is an obvious demand for developing new therapeutic strategies. Among them, the protein annexin A1 (ANXA1) has shown its active participation in inflammatory processes. AIM: In the present study we investigated the influence of anti-inflammatory treatment in human retinal pigment epithelial cells (ARPE-19), on the morphology, proliferation, migration and gene and protein expression. MATERIALS AND METHODS: The ARPE-19 cells were cultured in complete medium and stimulated by bacterial lipopolysaccharide (LPS), and in another experiment was added treatment with ANXA1Ac2-26 peptide, to evaluate the possible antiinflammatory effects of this protein, in 1, 2, 4, 24, 48 and 72 hours on the morphology, cell proliferation and migration. After statistical analyzes, which demonstrated that the time 72 hours is the best, was performed a new culture bottles for RNA extraction technique and conducted the Rapid Subtractive Hybridization (RaSH). The validation of five genes founded differentially expressed was done by RT-qPCR. In addition to these techniques was also analyzed the expression of anti and pro-inflammatory cytokines by Multiplex assay. RESULTS: The ANXA1Ac2-26 did not alter the morphology of the ARPE19 cells, however decreased proliferation and increased cell migration. After statistical analysis, it was evident that the time of 72 hours was the best to proceed with the methodology. By RaSH technology, after treatment with the peptide, were found 80 differentially expressed genes. Five of those genes (LRAT, CTGF, MAP1B, ALDH1A3 and SETD7), due its functions are related to eye and/or inflammatory diseases, were validated by RT-qPCR. Also were interconnected the signaling pathways, of which ANXA1 participates, important to the inflammatory process by Ingenuity Sistems©. Regarding the analysis of cytokine expression, we observed that the treatment with ANXA1Ac2-26 diminish the expression of pro-inflammatory molecules at a concentration of 100 µg/ml. CONCLUSSION: Our in vitro analyzes show that the protein ANXA1 can interact in signaling cascades of inflammatory processes, altering proliferation, migration

and gene and protein expression in the cells. Thus, our results suggest that the Retinal Pigment Epithelial cells (RPE) are a potential target of the activity of protein ANXA1, considering their potential use in innovative therapies for ocular inflammation’s treatment.
Keywords: Annexin A1, Ocular inflammation, Cell culture, RaSH, Gene expression.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. Análise morfológica da linhagem celular ARPE-19 ___________________ 61
Figura 2. Efeitos dos tratamentos com o peptídeo ANXA1Ac2-26 na proliferação das células ARPE-19. _____________________________________________________ 63
Figura 3. Ensaio de migração com linhagem celular ARPE-19. _________________ 65
Figura 4. Relação dos genes obtidos na subtração das células induzidas pelo LPS (Sub A)._________________________________________________________________ 67
Figura 5. Relação dos genes obtidos na subtração das células tratadas com ANXA1Ac226 (Sub B).___________________________________________________________ 69
Figura 6. Validação da integridade do mRNA e cDNA. ________________________ 71
Figura 7. Expressão gênica por PCR em tempo real. _________________________ 73
Figura 8. Expressão gênica por PCR em tempo real. _________________________ 75
Figura 9. Efeito do peptídeo ANXA1Ac2-26 nos níveis de expressão de citocinas pró e anti-inflamatórias. _____________________________________________________ 77
Figura 10. Efeito do peptídeo ANXA1Ac2-26 nos níveis de expressão de citocinas pró e anti-inflamatórias. _____________________________________________________ 79

LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Genes, selecionados por RaSH, expressos na linhagem celular ARPE-19 com expressão aumentada após ativação pela endotoxina e, reduzida nas tratadas com ANXA1Ac2-26. _________________________________________________________ 81
Tabela 2. Genes, selecionados por RaSH, com expressão aumentada na linhagem celular ARPE-19 tratadas com ANXA1Ac2-26 e, reduzida nas ativadas pelo LPS. _____ 82
Tabela 3. Descrição dos genes escolhidos para validação por PCR em tempo real. _ 88

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Pl: microlitros
%: porcentagem
>: Maior
≤: Menor ou igual
°C: Graus célsius
µg: microgramas µM: Micromolar
ALDH1A3: Família Aldeído Desidrogenase 1, membro 3 AMP: Adenosina monofosfática cíclica ANX: Anexinas ANXA1: Gene da proteína Anexina A1, 28; Proteína Anexina A1 ANXA1Ac2-26: Peptédio da porção N-terminal da proteína ANXA1 ARPE-19: Linhagem celular de Células Epiteliais Pigmentadas da Retina Humana
Br: Brasil
Ca2+: Íon calcio cDNA: DNA complementar cm2: centímetros quadrados cm3: centímetros cúbicos CO2: Gás carbônico cPLA2: Fosfolipase citosólica A2 CREB: Proteína ligadora do elemento respondedor de AMP cíclico Ct: Cycle threshold CTGF: Fator de Crescimento de Tecido Conjuntivo
DMEM: Meio de cultivo Dulbecco Eagle modificado DMRI: Degeneração Macular Relacionada com a Idade DNA: Ácido desoxirribonucleico
EDTA: Ácido etilenodiamino tetra-acético EGF: Fator de crescimento epidérmico EPR: Epitélio Pigmentado da Retina ERK: Quinase regulada por sinais extracelulares

FDEP: Fatores derivados do epitélio pigmentado Fpr-rs: Receptor murino para peptídeos formilados
GC: Glicocorticóides GO: Gene Ontology
Ham F-12: Mistura de nutrientes para cultura hs: horas
IBILCE: Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas IL: Interleucina INF-γ: Interferon gama
K/BxN: Soro artritogênico kDa: Kilodalton
Log2: Escala logarítmica de base 2 LPS: Lipopolisacarídeo bacteriano LRAT: Lectina Retinol Acetiltransferase (fosfatidilcolina-retinol O-aciltransferase)
MAP1B: Proteína associada ao microtúbulo 1B MAPK: Proteína quinase ativada por mitógeno MCP-1: Proteína quimiotática para monócitos mg: Miligrama min: Minutos ml: Mililitro mM: Milimolar
NF-κB: Fator de crescimento nuclear kappa B ng: Nanograma
PCR: Reação em cadeia da polimerase PGE2: Prostaglandina E2 PKC: Proteína kinase C Pol: Polimerase
Rantes: Expressão e secreção de Células T reguladas e normais RaSH: Hibridização Subtrativa Rápida RefSeq: Sequências de referência RNA: Ácido Ribonucleico rpm: Rotação por minuto RT: Transcriptase reversa

SETD7: Domínio SET (lisina metiltransferase) 7 Sub A: tester= ARPE-19 induzida por endotoxina vs driver= ARPE-19 induzida por endotoxina e
tratadas com a proteína ANXA1Ac2-26 Sub B: tester= ARPE-19 induzida por endotoxina e tratadas com a proteína ANXA1Ac2-26 vs
driver= ARPE-19 induzida por endotoxina
TGF-E: Fator de crescimento transformante beta TGF-α: Fator de crescimento transformante alfa TLR4: Receptor toll-like 4 TNF-α: Fator de necrose tumoral alfa
U: Unidades UK: Reino Unido UNESP: Universidade Estadual Paulista
VEGF: Fator de crescimento vascular endotelial
Δ: Delta

SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ________________________________________________________ 23 1.1 Objetivos _________________________________________________________ 33
2. MATERIAL E MÉTODOS ________________________________________________ 34 2.1 Linhagem celular ARPE-19 __________________________________________ 35 2.2 Tratamentos farmacológicos _________________________________________ 35 2.3 Índice de Proliferação Celular ________________________________________ 37 2.4 Ensaio de Migração ________________________________________________ 38 2.5 Hibridização Subtrativa Rápida (RaSH)_________________________________ 39 2.6 PCR quantitativa (RT-qPCR) _________________________________________ 41 2.7 Ensaios Multiplex para análise de citocinas_____________________________ 43 2.8 Análises dos dados ________________________________________________ 44
3. RESULTADOS ________________________________________________________ 45 3.1 Morfologia Celular _________________________________________________ 46 3.2 Índice de Proliferação Celular ________________________________________ 46 3.3 Migração Celular___________________________________________________ 46 3.4 Hibridização Subtrativa Rápida (RaSH)_________________________________ 46 3.5 Ingenuity Systems© ________________________________________________ 47 3.6 PCR Quantitativa – RT-qPCR _________________________________________ 48 3.7 Ensaios Multiplex para análise de citocinas_____________________________ 49
4. DISCUSSÃO __________________________________________________________ 50 5. CONCLUSÕES ________________________________________________________ 57 6. FIGURAS ____________________________________________________________ 59 7. TABELAS ____________________________________________________________ 80 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ________________________________________ 89 ANEXO_________________________________________________________________ 101

1. INTRODUÇÃO

INTRODUÇÃO - 24 O olho é um órgão altamente especializado, que traduz estímulos luminosos em sinais elétricos e retransmite esses sinais para o córtex visual (Figura 1). A percepção da luz e formação da imagem é mediada pela ativação dos fotorreceptores, localizados na camada mais externa da retina, e é nessa camada que a luz ativa uma cascata de sinalização e propaga o impulso elétrico. Essa foto-ativação é iniciada após isomerização do 11-cis-retinal nos segmentos externos dos fotorreceptores, assim a continuação do ciclo visual é dependente da reposição constante de 11-cis-retinal, uma função desempenhada pelo epitélio pigmentado da retina (EPR) (LIPINSKI; THAKE; MACLAREN, 2013).
Figura 1. Esquema do olho humano com destaque para a retina. Fonte: GOWDAK; GOWDAK, 1989.
O olho é um órgão privilegiado imunologicamente, onde respostas inflamatórias são suprimidas. Muitos fatores são responsáveis por essa supressão, como a presença de uma barreira hemato-retiniana (CAI; BRANDT, 2008), que isola inúmeros fatores imunes transportados pela circulação sanguínea (LEUNG; BARNSTABLE; TOMBRAN-TINKA, 2009). O

INTRODUÇÃO - 25 EPR é o principal componente da barreira hemato-retiniana (LEUNG; BARNSTABLE; TOMBRAN-TINKA, 2009), com importante papel na manutenção da nutrição e tolerância imune do olho (STREILEIN, 2003). Esse epitélio (Figura 2) é constituído por uma monocamada de células de origem ectodérmica, aderidas à superfície interna da membrana de Bruch, diretamente posicionada sobre os segmentos externos dos fotorreceptores, e interconectadas por complexos juncionais que consistem em junções gap, oclusão e desmossomos (KOEVARY, 2000).
Figura 2. Esquema das camadas da retina humana, destacando o epitélio pigmentado e a barreira hemato retiniana. Fonte: http://www.infoescola.com/visao/retina/ e http://www.eyeconnectamd.ca/dryamd.aspx.
O EPR, localizado entre a retina neurosensorial e a coreóide, é uma monocamada de células vitais para a manutenção da função e integridade dos fotorreceptores (CARR et al, 2011). Essas células têm as funções físicas, ópticas, metabólicas, bioquímicas e de transporte, que exercem importante papel na visão normal. Entre esses papéis destacamos a absorção e

INTRODUÇÃO - 26
concentração da luz dentro do olho, melhorando a resolução da imagem e manutenção da adesão da retina neurosensorial. Ainda, o EPR fornece uma barreira de permeabilidade seletiva entre a coreóide e a retina neurosensorial, fagocitose dos cones e bastonetes, síntese de matriz interfotoreceptora, transporte e armazenamento de metabólitos e vitaminas (FORRESTER et al., 1999).
Essas células EPR possuem um papel fundamental no ciclo visual, pois a sua conexão com os fotorreceptores, fagocitando e transformando o sinal luminoso em impulso elétrico, proporciona a base para uma boa visão (LIPINSKI; THAKE; MACLAREN, 2013). Nesse processo de interação entre as células EPR e os fotorreceptores, encontramos várias enzimas atuando na transformação dos compostos para completar o ciclo visual, uma dessas é a Lectina Retinol Acetiltransferase (fosfatidilcolina-retinol O-aciltransferase) (LRAT), que age nessas células em um momento específico formando os pigmentos que gerarão a imagem (TANG et al., 2012).
As células EPR suportam um alto nível de estresse oxidativo devido seus elevados níveis de consumo de oxigênio e alto teor lipídico poli-insaturados e, ainda, ampla exposição à luz (PAIMELA et al., 2007). O estresse oxidativo pode evocar um progressivo dano às células EPR que, secundariamente, causa efeitos adversos nos fotorreceptores (ZARBIN, 2004). Além do estresse oxidativo crônico, os processos inflamatórios também têm sido ligados à degeneração macular relacionada com a idade (DMRI) (ZARBIN, 2004).
A inflamação ocular aguda pode induzir o processo de uveíte, com vários graus de degeneração na retina e perda da visão (SHEN et al., 2000; AGRAWAL et al., 2010). Essa inflamação, que é caracterizada pelo acúmulo de leucócitos nos tecidos oculares, pode afetar qualquer parte do olho, sendo um processo doloroso e associado à fotofobia (BANSAL; GUPTA; GUPTA, 2010). A natureza recorrente desse processo inflamatório pode resultar em complicações secundárias como catarata, glaucoma, descolamento de retina e, por fim, destruição dos tecidos oculares e cegueira (JANCEVSKI; FOSTER, 2010; SRIVASTAVA; RAJAPPA; KAUR, 2010).
Dados recentes de Carr e colaboradores (2011), que estudaram as células epiteliais pigmentadas da retina humana (ARPE-19), demonstraram que in vitro essa linhagem tem o potencial de diferenciar-se para formar as demais camadas de células da retina. Esses autores utilizaram marcadores específicos para as diferentes células presentes na retina, e os resultados mostraram que nas células ARPE-19 foram detectados marcadores para fotorreceptores e células da retina sensorial, como as células ganglionares, amácrinas e astrócitos, dessa forma observa-se um potencial regenerativo, caso ocorra alguma lesão.

INTRODUÇÃO - 27
Há vários tipos de processos patológicos que podem acometer a retina, todos promovem perda significante da visão. Acredita-se que as células EPR têm um papel na vitreoretinopatia proliferativa, na transição de células epiteliais para células mesenquimais mediando a fibrose e, relacionado com essa função, o Fator de Crescimento de Tecido Conjuntivo (CTGF), possui correlação com os níveis de fibrose em doenças vitreoretinais (CHEN et al., 2012).
Outras patologias na retina, como hemorragia retiniana (CELIK et al., 2006), podem ser induzidas pelo lipopolissacarídeo (LPS) de bactérias gram-positivas incluindo Saccharomyces aureus e Escherichia coli, enquanto de Chlamydia pneumoniae (cLPS) pode apresentar correlação com a progressão da degeneração macular relacionada com a idade (ROBMAN et al., 2005).
Na retina, o LPS aumenta a concentração de citocinas pró-inflamatórias, sendo também um potente desencadeador da ativação da micróglia (WANG et al., 2005; YANG; ZHI; TSO, 2007) e astrócitos no tecido nervoso (JANG et al., 2007). Essa endotoxina pode estimular diretamente as células EPR nas concentrações entre 100 ng/ml e 1mg/ml, produzindo respostas inflamatórias e sinais apoptóticos (NAGINENI; DETRICK; HOOKS, 1994; GARCIA-CABANES et al., 2001; ELNER et al., 2003; KOGA et al., 2003). As células EPR expressam vários receptores de LPS, incluindo CD14 e o toll-like 4 (TLR4) que têm importante papel na defesa contra uma variedade de patologias oculares (KINDZELSKII et al., 2004; ELNER et al., 2005; PAIMELA et al., 2007).
Alguns fatores secretados pelas células EPR podem inibir diretamente a imunidade adaptativa e inata (NISHIDA; TAYLOR, 1999; TAYLOR; YEE, 2003; KAESTEL et al., 2005). O fator de crescimento transformante α (TGF-α) e a trombospondina, ambos secretados pelas células EPR, podem bloquear a ativação da célula Th1 e promover tolerância sistêmica de antígenos no microambiente ocular (ZAMIRI et al., 2005; UNO et al., 2006). Essas células podem ainda regular a imunidade inata pela supressão da inflamação induzida por macrófagos, por meio da secreção de fatores derivados do epitélio pigmentado (FDEP) (ZAMIRI et al., 2006). Esses estudos indicam que as células EPR exercem um papel fundamental nos processos inflamatórios da retina (LEUNG; BARNSTABLE; TOMBRAN-TINKA, 2009).
Na inflamação ocular, o EPR tem efeito imunossupressor sobre a proliferação de linfócitos por meio da produção de prostaglandina (LIVERSIDGE et al., 1993). Ainda, as células EPR são capazes de expressar o complexo principal de histocompatibilidade classe II, uma importante molécula imunorregulatória, podendo apresentar antígenos às células T (TEDESCO et al., 2004), e produzir TGF-E bioativo que é, em parte, responsável pela ativação dos macrófagos. A interação entre essas células parece ser um importante fator nos processos

INTRODUÇÃO - 28
inflamatórios, imunológicos e de cicatrização, provavelmente envolvidos na proliferação vítreoretiniana.
A inflamação é o principal fator contribuinte para inúmeros distúrbios oculares (LEUNG; BARNSTABLE; TOMBRAN-TINKA, 2009) e no tratamento desses processos intra-oculares, os glicocorticóides são os medicamentos freqüentemente administrados (YEUNG et al., 2003). No entanto, há o risco de efeitos adversos, como elevação da pressão intraocular (JONAS; KREISSIG; DEGENRING, 2003), cataractogênese (YOSHIKAWA et al., 1995) e citotoxidade às estruturas oculares, como as células EPR (MCGHEE; DEAN; DANESH-MEYER, 2002). Além disso, os glicocorticóides não devem ser administrados em pacientes infectados com HIV, com transplantes ou com outras terapias imunossupressoras (HEGAB; AL-MUTAWA, 2003). Um dos mediadores anti-inflamatórios endógenos, induzido pelos glicocorticóides e responsável pela inibição da síntese de eicosanóides e de fosfolipase A2 é a proteína anexina A1 (ANXA1) (BLACKWELL et al., 1980; FLOWER, 1988). Esta proteína tem sido investigada como um agente terapêutico anti-inflamatório.
As anexinas (ANX) compreendem uma superfamília bem conservada de proteínas, com pelo menos 13 membros descritos, relacionadas estruturalmente e caracterizadas por um domínio C-terminal homólogo com 4 a 8 repetições de 70-75 aminoácidos, responsável pelas suas propriedades ligadoras de cálcio e fosfolipídeos (Figura 3). A região variável N-terminal, que é única em comprimento e sequência para cada membro da família, inclui sítios potenciais de fosforilação, glicosilação e ação de peptidase (GERKE; MOSS, 2002). Essa família de proteínas são encontradas em muitos organismos, desde leveduras a plantas e mamíferos, preferencialmente no citosol, associadas à membrana plasmática ou ao citoesqueleto. Sua função não está completamente esclarecida, mas existem evidências de sua participação em transdução de sinais (MOSS; MORGAN, 2004), transporte de vesículas (DIAKONOVA et al., 1997), inibição da inflamação (GETTING; FLOWER; PERRETTI, 1997; OLIANI et al., 2001), duplicação de DNA (SMITH; MOSS, 1994), transformação celular (SOLITO et al., 1998), formação de canais de íons, inibição de coagulação, interação célula-matriz (CROXTALL; FLOWER; PERRETTI, 1993), proliferação e apoptose (PERRETI; FLOWER, 2004; D’ACQUISTO; PERRETTI; FLOWER, 2008).

INTRODUÇÃO - 29
Figura 3. Esquema da proteína anexina, mostrando os aminoácidos da região N terminal e as 4 repetições de 70-75 aminoácidos na região C terminal. RODRIGUES-LISONI; HENRIQUE; TAJARA, 2011.
A ANXA1, originalmente conhecida como lipocortina 1, foi o primeiro membro dessa família que teve seu gene clonado e é considerada o seu protótipo (WALLNER et al., 1986). O gene ANXA1 está localizado no cromossomo 9, em 9q12-21.2, apresenta 13 exons e codifica uma proteína de 37kDa.
Modificações pós-traducionais foram descritas, e pode ser considerada importante consequência intracelular alterando as propriedades da ANXA1. Uma das modificações é a clivagem do domínio N-terminal da proteína, formando uma molécula truncada com alteração da sua sensibilidade ao Ca2+ e da localização intracelular, essa clivagem pode ser considerada um evento regulatório para sua ação (GERKE; MOSS, 2002). A ação anti-inflamatória e antiproliferativa tem sido mostrada em estudos in vivo e in vitro, após administração da ANXA1 exógena ou seu peptídeo mimético da porção N-terminal (Ac2-26 e AcAMVSEFLKQAWFIENEEQEYVQTVK) (DA CUNHA; OLIANI; DAMAZO, 2012).
Além da função de inibidor da fosfolipase citosólica A2 (cPLA2), foi inicialmente verificado que os resíduos de tirosina da ANXA1 compreendem um substrato para fosforilação pelo receptor do fator de crescimento epidérmico (HUANG et al., 1986). Essas observações levaram à conclusão de que essa proteína representava um mediador da resposta antiinflamatória, uma hipótese posteriormente apoiada por estudos mostrando sua expressão elevada após administração de esteroides durante a inflamação (SOLITO et al., 1991).
A atividade de inibição de cPLA2 está presente também em todos os outros membros da família das anexinas, cuja análise detalhada e de suas sequências codificadoras resultaram em importantes informações sobre suas funções e regulação. Por exemplo, os dados de Antonicelli e colaboradores (2001) sobre sequências do promotor de ANXA1 de camundongo forneceram evidências do envolvimento do fator de transcrição CREB (proteína ligadora do elemento respondedor de AMP cíclico) na ativação desse gene por AMP cíclico ou glicocorticoides.

INTRODUÇÃO - 30
Alldridge e colaboradores (1999) observaram que a anexina regula os componentes proximais das cascatas de sinalização MAPK (proteína quinase ativada por mitógeno), o que pode explicar sua ação anti-proliferativa, talvez pela inibição da ciclina D1 ou pela indução da desorganização do citoesqueleto. Os elementos centrais da via de sinalização MAPK são proteínas quinases serina/treonina, que respondem a uma variedade de fatores de crescimento (como o fator de crescimento epidérmico) e seus receptores, citocinas e hormônios. Uma das cascatas MAPK melhor caracterizada compreende a das famílias Quinase regulada por sinais extracelulares (ERK 1 e 2), cuja ativação é importante para proliferação, desenvolvimento e diferenciação. Essa via é iniciada por receptores de fatores de crescimento ou receptores acoplados à proteína G, que desencadeiam uma série de fosforilações em mensageiros secundários, culminando na translocação de um deles para o núcleo e consequente indução da fosforilação de fatores de transcrição e de outras proteínas associadas a genes de resposta imediata (HAZZALIN; MAHADEVAN, 2002). As famílias ERK 1 e 2 participam de vias de sinalização que incluem famílias bem conhecidas em mamíferos, as quinases c-jun e MAPKs p38, que são importantes para desenvolvimento, inflamação e apoptose (PIERCE; PREMONT; LEFKOWITZ, 2002).
Silva e colaboradores (2011) observaram que a ANXA1 é um mediador importante na homeostase dos processos inflamatórios, sugerindo que a proteína possui uma ação no controle da ativação dos neutrófilos e na sua migração, contribuindo para a resolução da resposta inflamatória. Modelos de toxoplasmose ocular mostraram, por meio de análises himuno-histoquímicas, aumento na expressão de ANXA1 em neutrófilos e fagocitose de células mononucleares, durante a fase tardia da inflamação, indicando que essa proteína pode contribuir na resolução dos processos inflamatórios (MIMURA et al., 2012).
O mecanismo preciso pelo qual a ANXA1 inibe a proliferação celular não é bem conhecido, mas a maioria dos estudos indica seu papel na regulação do crescimento mediado pelos glicocorticóides (GC) (ALLDRIDGE; BRYANT, 2003). Esses compostos induzem a expressão da ANXA1 em vários tipos celulares, inclusive em neutrófilos (OLIANI et al., 2001), eosinófilos (OLIANI; DAMAZO; PERRETTI, 2002) e mastócitos (OLIANI et al., 2008) e, parecem levar à sua fosforilação e translocação para a superfície da célula (SOLITO et al., 2003a). Além disso, a ANXA1 também pode ser encontrada em células endoteliais, epiteliais de pulmão e sinoviócitos (PERRETTI et al., 1996; OLIANI et al., 2001; DAMAZO et al., 2005).
Após lesão, a inflamação é desencadeada e ocorre liberação de mediadores ou síntese de efetores como histaminas, ácido aracdônico, prostaglandinas e citocinas, cuja atuação supera o efeito inibidor de outros mediadores. Em consequência, os leucócitos transmigram e,

INTRODUÇÃO - 31
esse processo inclui etapas de adesão ao endotélio e diapedese. O acúmulo e a subseqüente ativação de leucócitos podem ser perpetuados e resultar em doenças que envolvem lesão e inflamação crônicas. Para regulação desse processo, é ativada uma série de sistemas de feedback que interrompem a migração leucocitária (VON ANDRIAN et al., 1992; MANCUSO; FLOWER; PERRETTI, 1995; PANÉS; PERRY; GRANGER, 1999). Entre esses estão os hormônios glicocorticóides, as citocinas IL10 e IL4, a adenosina, o óxido nítrico, a prostaciclina, a catepsina G e a ANXA1 (PERRETTI, 1997).
Durante o processo de inflamação, a liberação do ácido aracdônico a partir de fosfolipídeos celulares, e sua quebra em metabólitos, resulta em vários efeitos biológicos, entre eles a vasodilatação. Essa liberação é decorrente da ação das fosfolipases A2 que, por sua vez, são ativadas por diferentes estímulos. Um deles envolve a cascata de sinalização desencadeada por recrutamento de Grb2 e p21ras, iniciada pelo receptor do fator de crescimento epidérmico, com consequente fosforilação da fosfolipase e sua ligação ao cálcio. O processo é inibido pelos GCs, que promovem a redução dos níveis de moléculas de adesão e fosforilação da ANXA1 (NEWMAN et al., 1997; SOLITO et al., 1998; CROXTALL; CHOUDHURY; FLOWER, 2000).
O efeito inicial dos GCs sobre a ANXA1 é a translocação dessa proteína do citoplasma para a superfície externa da célula, onde é retida por um mecanismo dependente de Ca 2+ (TAYLOR et al., 1993). Solito e colaboradores (1998) sugerem que a forma citosólica bloqueia a cPLA2 e a forma extracelular também atua como regulador negativo do processo inflamatório. Oliani e colaboradores (2001) observaram que a isoforma citosólica (com 37kDa) está presente em neutrófilos circulantes. A adesão dessas células ao endotélio aparentemente causa externalização da proteína na membrana plasmática do leucócito. A segunda isoforma (com 33kDa) foi observada principalmente em neutrófilos extravasados e teve localização intracelular. A presença da ANXA1 na membrana plasmática (DIAKANOVA et al., 1997) e sua habilidade para associação com a bicamada lipídica pode estar relacionada com o recrutamento de proteínas de sinalização para a membrana.
O processo de translocação da ANXA1 envolve fosforilação de um resíduo de serina e é dependente da proteína kinase C (PKC), do padrão MAPK (SOLITO et al., 2003b) e, provavelmente, de um transportador ABC1 (JOHN et al., 2002). A ANXA1 humana contém vários sítios de fosforilação canônicos (inclusive Tyr21, Ser27, Ser44, Ser45, Thr24, Thr261, His246 e His293) (PEPINSKY, 1991; HAIGLER; SCLAEPFER, 1992). A fosforilação dependente de PKC ou src nos resíduos de serina é crítica para sua exportação induzida por GCs, em especial na Ser27. A fosforilação desencadeada pelo fator de crescimento semelhante ao EGF e presente

INTRODUÇÃO - 32
na tirosina 21 está relacionada com promoção tumoral e proliferação excessiva e a torna inativa como inibidor de cPLA2 (DE COUPADE et al., 2000).
A exportação de ANXA1 é um mecanismo importante que permite à proteína acessar receptores na superfície de outras células e assim exercer ações regulatórias parácrinas. Realmente, sítios com alta afinidade de ligação da ANXA1 já foram identificados em uma variedade de células tais como as da adenohipófise (CHRISTIAN et al., 1997), neutrófilos (PERRETTI et al., 2002) e em diferentes linhagens celulares, como células de linfoma histiocítico difuso e células foliculares estreladas extraídas de tumor da pituitária (SOLITO et al., 2001; TIERNEY et al., 2003).
Análises realizadas recentemente no nosso laboratório, demonstraram imunocitoquimicamente, a ligação da ANXA1 com o receptor Fpr-rs2 em neutrófilos de camundongos induzidos à peritonite aguda, sugerindo que a ação anti-inflamatória da ANXA1 pode ser mediada pelo receptor (GASTARDELO et al. 2009). Em outro estudo foi observado que a administração do Boc2, antagonista do FPR, anula os efeitos anti-inflamatórios da injeção sistêmica do peptídeo (GIROL, 2012).
Abordando o olho, Girol (2012), após verificar a ação anti-inflamatória da ANXA1 exógena, analisou a expressão endógena da proteína, demonstrando, pela primeira vez na literatura, a presença da ANXA1 nos tecidos oculares nas condições inflamatórias. Em outro modelo de inflamação, artrite induzida por soro K/BxN em camundongos, também foi demonstrado a ação dos glicocorticóides, via ANXA1(PATEL et al., 2012).
Solito e colaboradores (2003b) propuseram outro mecanismo pelo qual a ANXA1 inibe a inflamação. Esses autores levantaram a hipótese de que a elevação dos níveis de ANXA1 e sua translocação para a membrana, durante a adesão dos leucócitos ao endotélio, provoca não apenas a redução dessa adesão, mas também o encaminhamento da célula para a apoptose. Da mesma maneira, a ANXA1 promoveria a apoptose de leucócitos no sítio da inflamação, quando sua síntese está aumentada. Realmente, a expressão elevada de ANXA1 já foi associada com o aumento da atividade da caspase 3, uma enzima chave no desencadeamento da apoptose (SOLITO et al., 2001). Como a cPLA2 é um substrato da caspase-3 (ATSUMI et al., 1998), este mecanismo indireto anti-PLA da ANXA1 deve levar a uma diminuição da produção de prostaglandina E2 (PGE2), um metabólito pró-apoptose da cPLA2, o que reforça o potencial pró-apoptótico da ANXA1.
Uma nova descoberta relacionada com a sinalização da ANXA1 é que essa proteína pode ser associada diretamente com a subunidade p65 do fator de transcrição de ubiquitina NFκB, uma chave regulatória da proliferação celular e expressão dos genes de inflamação

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(ZHANG et al., 2010). Esse fato destaca caminhos alternativos pelos quais a ANXA1 pode modular localmente os processos inflamatórios (HUTCHINSON et al., 2011).
Desse modo, os trabalhos relacionados com a ANXA1 têm contribuído para um maior entendimento do papel dessa proteína no processo inflamatório. No entanto, os mecanismos moleculares pelos quais a ANXA1 modula as respostas celulares nos processos inflamatórios ainda não estão completamente determinados. Além disso, são raros os relatos sobre o papel anti-inflamatório da ANXA1 nas doenças oculares. Os dados disponíveis sugerem que essa família de proteínas pode ter, além do seu importante papel no processo inflamatório, um envolvimento significativo em outras doenças, inclusive no câncer, por meio de cascatas de sinalização que incluem genes relacionados com o ciclo celular, diferenciação e apoptose.
Diante dessas considerações, e da necessidade de novas terapias para o tratamento das inflamações oculares em substituição às atuais, como por exemplo, os corticosteróides que apresentam efeitos adversos (DUNN, 2004), investigamos, in vitro, o efeito da administração da ANXA1, nas células ARPE-19 após ativação pelo inflamógeno LPS, em busca de uma via nas cascatas gênicas de sinalização, para a possível descoberta de futuros marcadores moleculares e alternativa terapêutica ocular inovadora.
1.1 Objetivos Objetivo geral Em função da importância do possível efeito anti-inflamatório do peptídeo ANXA1Ac2-26 nas células epiteliais pigmentadas da retina humana (ARPE-19), após ativação pelo inflamógeno lipopolissacarídeo bacteriano (LPS), foi avaliado como a proteína modula a expressão gênica e como essas alterações podem participar do processo inflamatório.
Os objetivos específicos compreenderam os seguintes aspectos:
i. o efeito do peptídeo ANXA1Ac2-26 in vitro nas células ARPE-19 controles e estimuladas pelo LPS na morfologia, no índice de proliferação celular e migração celular e na expressão gênica.
ii. as dosagens das citocinas pró e anti-inflamatórias. iii. a expressão dos genes diferencialmente expressos como possíveis marcadores moleculares potencialmente relacionados com os tratamentos anti-inflamatórios. iv. as vias de sinalização celular das quais a ANXA1 participe, importantes para o processo inflamatório.

2. MATERIAL E MÉTODOS

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Os procedimentos experimentais foram conduzidos de acordo com as normas da Comissão de Ética em Pesquisa do IBILCE/UNESP, protocolo 0012.0.229.000-11 e parecer 043/11 (Anexo).
2.1 Linhagem celular ARPE-19 A linhagem celular ARPE-19 foi cultivada em uma mistura (1:1) de meio Dulbecco Eagle modificado e Ham F-12 (DMEM:F-12) (Cultilab, Br) de acordo com Dunn et al. (1996), e semeadas em garrafas de cultura de 25 cm2, na concentração de 104 células, suplementado com 10% de soro fetal bovino (Cultilab, Br), 200 mM L-glutamina, 0,1 mg/mL de estreptomicina e 100 U/mL de penicilina (Invitrogen, UK) e mantidas a 37°C em atmosfera de 5% de CO2 por 24 horas, até serem fixadas no substrato. Após esse período, o meio foi trocado a cada dois ou três dias, ou até se tornar confluente. O crescimento e a morfologia celular foram avaliados diariamente em microscópio invertido e, quando a densidade celular se mostrou alta (80-90%), o material foi submetido à desagregação celular por meio de tripsina e subdividido em duas réplicas.
2.2 Tratamentos farmacológicos As células ARPE-19 foram subdivididas em três grupos: a) controle, sem tratamento; b) submetidas à indução da inflamação pela endotoxina lipopolissacarídeo bacteriano (LPS, tipo Escherichia coli, sorotipo 0127:B8, Sigma Chemical Co. Poole, Dorset, UK) na concentração de 10 µg/mL (PAIMELA et al., 2007) por 24 horas (MIMURA, 2012) e c) submetidas à indução por LPS e tratadas com o peptídeo ANXA1Ac2-26 (Ac-MVSEFLKQAWFIENEEQEYVQTVK) da proteína ANXA1 (RAYNAL; POLLARD, 1994), na concentração de 5 µg/mL e 100 µg/mL. As concentrações de tratamento foram escolhidas pelos resultados obtidos previamente em nosso grupo, no qual a concentração de 5 µg/mL (RODRIGUES-LISONI, et al., 2006), e a de 100 µg/mL (MIMURA, 2012), observaram o potencial anti-inflamatório do ANXA1Ac2-26 somente nessas concentrações. Os tratamentos foram realizados durante os períodos de 1, 2, 4, 24, 48 e 72 horas (GASTARDELO, 2012), para determinação do tempo estatisticamente significante para continuar os ensaios de análise das expressões gênicas diferenciais e dos mediadores pró e anti-inflamatórios, de acordo com os fluxogramas a seguir.

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2.3 Índice de Proliferação Celular As amostras controle não foram induzidas por LPS e nem tratadas com o ANXA1Ac2-26. Para análise do índice de proliferação celular, foi realizada uma curva de crescimento, com contagem de células cultivadas em placas de cultura de 6 poços, semeadas na concentração de 5x104 células por poço. O experimento foi realizado em triplicatas. Após esse período, o meio de cultura completo foi substituído por meio sem soro (DMEM:F-12 0%), a fim de deixar todas as células na mesma etapa celular. Após 24 horas, o meio sem soro foi substituído pelo meio completo e adicionado LPS [10 µg/mL] em um conjunto de poços correspondentes aos grupos LPS e LPS + ANXA1Ac2-26. As células que receberam o LPS ficaram com esse meio por 24 horas para indução do processo inflamatório (MIMURA, 2012). Após, as células foram tratadas com o ANXA1Ac2-26, na concentração final de 5 µg/mL, nos períodos de 1, 2, 4, 24, 48 e 72 horas. As células foram desagregadas por ação da tripsina e quantificadas em Countess® Automated Cell Counter (Invitrogen®), utilizando o corante Trypan Blue, nos diferentes tempos. Esse experimento foi realizado em triplicatas e de acordo com Figura 1.

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Figura 1. Modelo de três placas com 6 poços contendo apenas um tipo celular (ARPE-19) com diferentes tratamentos (controle, LPS e LPS/ ANXA1Ac2-26) e coletados nos seis diferentes tempos do experimento (1, 2, 4, 24, 48 e 72 horas).
2.4 Ensaio de Migração As células ARPE-19 foram incluídas em uma placa de 24-poços, após 24 horas o meio de cultura foi trocado seguindo as condições de tratamento, 3 poços controle, co

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