UNIVERSIDADE DO ESTADO DE SANTA CATARINA – UDESC CENTRO DE CIÊNCIAS TECNOLÓGICAS – CCT DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA ELÉTRICA – DEE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA ELÉTRICA - PPGEEL

  

UNIVERSIDADE DO ESTADO DE SANTA CATARINA – UDESC

CENTRO DE CIÊNCIAS TECNOLÓGICAS – CCT

DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA ELÉTRICA – DEE

PROGRAMA DE PốS-GRADUAđấO EM

  

ENGENHARIA ELÉTRICA - PPGEEL

  Formação: Mestrado Profissional em Engenharia Elétrica DISSERTAđấO DE MESTRADO OBTIDA POR

  Carlos Toshiyuki Matsumi

  

PROJETO E CONSTRUđấO DE UM ELETROPERMEABILIZADOR

DE CÉLULAS BIOLÓGICAS

Joinville

2009

  

UNIVERSIDADE DO ESTADO DE SANTA CATARINA – UDESC

CENTRO DE CIÊNCIAS TECNOLÓGICAS – CCT

DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA ELÉTRICA – DEE

PROGRAMA DE PốS-GRADUAđấO EM

  

ENGENHARIA ELÉTRICA - PPGEEL

DISSERTAđấO DE MESTRADO PROFISSIONAL

Mestrando: CARLOS TOSHIYUKI MATSUMI – Engº Eletricista

Orientador: Prof. Dr. AIRTON RAMOS

  

Co-orientador: Prof. Dr. PEDRO BERTEMES FILHO

CCT/UDESC - JOINVILLE

PROJETO E CONSTRUđấO DE UM ELETROPERMEABILIZADOR

DE CÉLULAS BIOLÓGICAS

  DISSERTAđấO APRESENTADA PARA OBTENđấO DO TễTULO DE MESTRE EM ENGENHARIA ELÉTRICA DA UNIVERSIDADE DO ESTADO DE SANTA CATARINA, CENTRO DE CIÊNCIAS TECNOLÓGICAS – CCT, ORIENTADA PELO PROF. DR. AIRTON RAMOS.

  

Joinville

2009

  

CARLOS TOSHIYUKI MATSUMI

PROJETO E CONSTRUđấO DE UM ELETROPERMEABILIZADOR

DE CÉLULAS BIOLÓGICAS

  ‘Esta dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em Engenharia Elétrica – Automação Industrial e aprovada em sua forma final pelo Programa de Pós- Graduação em Engenharia Elétrica da Universidade do Estado de Santa Catarina’.

  Banca Examinadora:

  Orientador: __________________________________________ Prof. Dr. Airton Ramos Universidade do Estado de Santa Catarina – UDESC

  Membros: __________________________________________ Prof. Dra. Daniela Ota Hisayasu Suzuki Universidade Federal de Santa Catarina – UFSC

  __________________________________________ Prof. Dr. Pedro Bertemes Filho (Co-orientador) Universidade do Estado de Santa Catarina – UDESC __________________________________________ Prof. Dr. Fabio Rodrigues De La Rocha Universidade do Estado de Santa Catarina – UDESC

Joinville, SC, Julho de 2009.

  FICHA CATALOGRÁFICA NOME: MATSUMI, Carlos Toshiyuki DATA DEFESA: 31/07/2009 LOCAL: Joinville, CCT/UDESC NÍVEL: Mestrado Número de ordem: 16 – CCT/UDESC FORMAđấO: Engenharia Elétrica ÁREA DE CONCENTRAđấO: Automação de Sistemas

  

TÍTULO: “Projeto e Construção de um Eletropermeabilizador de Células

Biológicas”

PALAVRAS – CHAVE: Eletropermeabilização. Eletropermeabilizador. Amplificador de alta tensão. Condutividade de suspensão de células. NÚMERO DE PÁGINAS: 65p. CENTRO/UNIVERSIDADE: Centro de Ciências Tecnológicas da UDESC PROGRAMA: Pós-graduação em Engenharia Elétrica – PPGEEL o N CAPES: 41002016012P-0 ORIENTADOR: Dr. Airton Ramos CO- ORIENTADOR: Dr. Pedro Bertemes Filho PRESIDENTE DA BANCA: Dr. Airton Ramos

  Dra. Daniela Ota Hisayasu Suzuki, Dr. Pedro Bertemes Filho e

MEMBROS DA BANCA:

  Dr. Fabio Rodrigues De La Rocha

  À Deus. Aos meus filhos e minha esposa.

  

AGRADECIMENTOS

  Agradeço primeiramente a Deus por me conceder o dom da vida e por ter me iluminado por mais esta fase da minha vida.

  Ao meu Orientador, Prof. Dr. Airton Ramos, pela orientação, dedicação, amizade e pelos ensinamentos durante esta dissertação.

  À Dra. Daniela, pela atenção, supervisão e orientação nos procedimentos experimentais realizados no Centro de Ciências Biológicas – CCB/UFSC.

  A empresa ELETROSPARK em nome do Sr. Arlindo Benvenutti e Sr. Jair Sedrez, pelo apoio e amizade dispensados sempre que solicitados.

  A empresa AMDS4, representante da LEM transdutores pela doação do transdutor, em nome do Sr. José Eduardo Antonio e Simone Antonio Ciambelli.

  A SEMIKRON SEMICONDUTORES LTDA, em nome do Sr. Dirceu Soncini, pela doação do dissipador indispensável para este trabalho.

  Ao colega de mestrado Rodrigo Alécio Stiz pela amizade e apoio durante o mestrado. Ao bolsista Jean Ricardo Rusczak do Laboratório de Instrumentação Eletrônica e Biomédica do CCT-UDESC, pela amizade e auxílio no desenvolvimento do software.

  A todos os colegas do IF-SC – Instituto Federal de Educação Tecnológica – Unidade Joinville, em especial à Profª Dra. Ana Barbara K. Sambaqui e Profº Msc. José Flávio Dums pelo apoio e compreensão dispensados sempre que solicitados.

  Aos técnicos do IF-SC: José Adriano Damacena Diesel, Ludgério Pereira Neto e Márcio Roberto Nunes pelo auxílio.

  A todos os amigos, que abdicaram de tão importante tempo da nossa amizade. E principalmente, aos meus filhos Vinicius, Guilherme e Alexandre e à minha esposa, Fabiana pelo amor e carinho.

  

PRODUđấO ACADÊMICA

  Artigos completos em Anais de Congresso MATSUMI, C. T.; RUSCZAK, J. R.; RAMOS, A.; SUZUKI, D. O. H.; MARQUES, J. L.

  B.; Desenvolvimento de um eletroporador de células biológicas. XXI Congresso Brasileiro de Engenharia Biomédica, pg. 649-652, novembro de 2008. Salvador, Bahia.

  

RESUMO

  Eletropermeabilização é o processo de aumento transitório da permeabilidade das membranas de células biológicas submetidas a campos elétricos intensos. Esta é uma técnica atualmente ainda em desenvolvimento e que possui importantes aplicações clínicas e tecnológicas tais como a eletroquimioterapia e a transferência genética. Os eletropermeabilizadores são equipamentos usados na geração e aplicação desses campos intensos. Esta dissertação apresenta o projeto, construção e teste de um eletropermeabilizador para uso em pesquisa biomédica. O equipamento proposto apresenta versatilidade e desempenho adequados para permitir a realização de diferentes tipos de ensaios com tecidos biológicos ou suspensões de células. É constituído de um gerador de tensão com forma de onda programável, um amplificador de alta tensão e alta corrente de saída e um sistema de transdução de tensão e corrente na amostra analisada. Tanto a geração de sinal quanto os valores medidos na carga são monitorados por um programa

  ®

  construído em ambiente LabVIEW que aciona uma placa de aquisição de dados com 16 bits de resolução. O desempenho do sistema eletrônico desenvolvido atende completamente os requisitos de projeto. O amplificador pode fornecer até 500V de amplitude de tensão com 5A de corrente de carga durante intervalos de tempo suficientes para os ensaios de eletropermeabilização. A banda passante pouco maior que 100KHz e os tempos de resposta ao degrau da ordem de 1 s são adequados para a realização de experimentos com diferentes formas de onda e diferentes tamanhos de células. Uma importante aplicação do equipamento construído é exemplificada com um experimento de eletropermeabilização em suspensão de hemácias de rato, sendo demonstrada a ocorrência de aumento da condutividade da amostra durante a estimulação com campo elétrico de alta intensidade.

  Palavras-chave: Eletropermeabilização. Eletropermeabilizador. Amplificador de alta tensão. Condutividade de suspensão de células.

  

ABSTRACT

  Electropermeabilization is the process of transient increase in the permeability of biological membranes of cells subjected to intense electric fields. This technique is currently still in development and has important clinical and technological applications such as electrochemotherapy and gene transfer. Electroporator is the equipment used in the generation and application of such intense fields. This dissertation presents the design, construction and testing of an electroporator for use in biomedical research. The proposed equipment presents versatility and performance appropriate to allow for different types of experiments with biological tissues or cell suspensions. It consists of a voltage generator with programmable wave form, a high voltage amplifier with high output current capability and a system for transduction of voltage and current in the sample. Both the generation of signal as the measured values in the load are monitored by a program built in

  ®

  LabVIEW environment that triggers a data acquisition card with 16 bits of resolution. The performance of the electronic system developed fully meets the requirements of project. The amplifier can deliver up to 500V and 5A to the load during a time interval enough for the testing of electropermeabilization. The bandwidth, slightly higher than 100kHz and the step response time of the order of 1 s are suitable for performing experiments with different waveforms and different sizes of cells. An important application of the equipment built is demonstrated with an experiment of electropermeabilization in suspension of red cells of rats. This result demonstrated the occurrence of increased conductivity of the sample during stimulation with high-intensity electric field.

  Keywords: Electropermeabilization. Electroporator. High voltage amplifier.

  Conductivity of cell suspensions.

  SUMÁRIO

  4.2.1 Resposta no tempo ao pulso de tensão .................................................................................... 49

  3.2 F ONTES DE ALIMENTAđấO DO AMPLIFICADOR .............................................................................. 40

  3.2.1 Fonte de Alimentação Fixa...................................................................................................... 40

  3.2.2 Fonte de Alimentação Ajustável .............................................................................................. 40

  3.3 SISTEMA DIGITAL DE GERAđấO E AQUISIđấO DE SINAIS ................................................................ 41

  3.4 T RANSDUTOR DE TENSÃO E CORRENTE ......................................................................................... 43

  3.5 I MAGEM DO SISTEMA C OMPLETO DE ELETROPERMEALIZAđấO ..................................................... 45

  

4 MÉTODOS E RESULTADOS EXPERIMENTAIS......................................................................... 46

  4.1 T ESTE DO SOFTWARE .................................................................................................................... 46

  4.2 T ESTES DO A MPLIFICADOR ........................................................................................................... 49

  4.2.2 Resposta em freqüência para uma onda quadrada ................................................................. 51

  3.1.3 Potência dissipada no amplificador ........................................................................................ 34

  4.3 E STABILIDADE T ÉRMICA ............................................................................................................... 53

  4.4 C URVA DE R ESPOSTA DO T RANSDUTOR DE TENSÃO ...................................................................... 54

  4.5 C URVA DE RESPOSTA DO T RANSDUTOR DE C ORRENTE ................................................................. 55

  4.6 E

  XPERIMENTO COM M ATERIAL B

  IOLÓGICO .................................................................................. 56

  4.6.1 Preparação das amostras e Estrutura de teste ........................................................................ 56

  4.6.2 Resultados................................................................................................................................ 57

  

5 CONCLUSÃO...................................................................................................................................... 61

  3.1.4 Análise dinâmica do Amplificador .......................................................................................... 36

  3.1.2 Análise do Amplificador .......................................................................................................... 32

  1 INTRODUđấO.................................................................................................................................... 14

  2.2.5 Administração de medicamentos via transdérmica ................................................................. 20

  1.1 O BJETIVOS .................................................................................................................................... 14

  1.2 E STRUTURA DO T RABALHO ........................................................................................................... 14

  

2 ELETROPERMEABILIZAđấO E ELETROPERMEABILIZADORES..................................... 16

  2.1 E LETROPERMEABILIZAđấO ........................................................................................................... 16

  2.2 T ERAPIAS E TÉCNICAS DE APLICAđấO DA ELETROPERMEABILIZAđấO ........................................... 18

  2.2.1 Eletroquimioterapia................................................................................................................. 18

  2.2.2 Eletrotransferência ou Transferência genética ....................................................................... 19

  2.2.3 Eletroinserção ......................................................................................................................... 19

  2.2.4 Eletrofusão .............................................................................................................................. 19

  2.2.6 Eletroesterilização................................................................................................................... 20

  3.1.1 Análise do Funcionamento do Amplificador ........................................................................... 31

  2.3 E LETROPERMEABILIZADORES ....................................................................................................... 21

  2.3.1 Gerador de onda exponencial decrescente (Descarga capacitiva) ......................................... 22

  2.3.2 Geradores de onda quadrada .................................................................................................. 22

  2.3.3 Gerador analógico unipolar de sinais arbitrários. ................................................................. 24

  2.3.4 Gerador analógico bipolar de sinais arbitrários .................................................................... 25

  2.3.5 Geradores modulares de alta tensão ....................................................................................... 26

  2.4 P ROPOSTA DE UM SISTEMA ELETRÔNICO A SER APLICADO NA PESQUISA EM ELETROPERMEABILIZAđấO .......................................................................................................................... 28

  

3 PROJETO DO SISTEMA ELETRÔNICO....................................................................................... 30

  3.1 O A MPLIFICADOR .......................................................................................................................... 30

  

6 REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA ................................................................................................... 62

  LISTA DE FIGURAS

  

Figura 1 - Efeitos da exposição de células a um campo elétrico intenso. Modificado de Puc et al, 2004....... 17

Figura 2 - Representação esquemática de uma célula esférica de raio “a” e espessura de membrana “h”...... 17

Figura 3 - Etapas de funcionamento do gerador de forma de onda exponencial decrescente, 1ª Etapa - carga

do capacitor, 2ª Etapa - descarga com a constante de tempo // . ................................... 22

  # $ R R C

  ! L "

Figura 4 - Gerador de pulsos quadrados com transistor, onde Q1 é um transistor MOSFET do tipo N.......... 23

Figura 5 - Gerador de onda quadrada com transformador de pulso................................................................. 23

Figura 6 - Gerador analógico unipolar de sinais arbitrários, onde Vin é a tensão de saída do gerador com forma de onda arbitrária......................................................................................................................... 24

Figura 7 - Distorção do sinal para amplificação superior aos limites da região linear. ................................... 25

Figura 8 - Gerador analógico bipolar. ............................................................................................................. 25

Figura 9 - Gerador modular de alta tensão, onde a tensão aplicada na amostra é a soma das tensões dos módulos utilizados. ................................................................................................................................ 26 Figura 10 - Representação esquemática de um sistema de geração e aquisição de sinal para estudo da eletropermeabilização de células biológicas. ......................................................................................... 29

Figura 11 - Diagrama esquemático do amplificador implementado................................................................ 30

Figura 12 - Estrutura da metade do amplificador, composta de: (a) amplificador de tensão e (b) amplificador

de potência. ............................................................................................................................................ 31

Figura 13 - Associação em série e paralelo de resistores de 15k /3 W para R1............................................ 32

  

Figura 14 - Análise “CC” das tensões e correntes do amplificador de tensão simulado. ................................ 33

Figura 15 - Circuito equivalente do pré-amplificador para análise “CA”. ...................................................... 34

Figura 16 - Resposta no tempo do amplificador. (a) onda senoidal. (b) onda quadrada.................................. 37

Figura 17 - Resposta no tempo para pulso positivo. (a) Detalhe da subida do sinal na carga. (b) Detalhe da descida do sinal na carga........................................................................................................................ 38

Figura 18 - Resposta em freqüência do Amplificador, (a) Espectro de Módulo. (b) Espectro de Fase........... 39

  

Figura 19 - Fonte de alimentação Fixa ± 300 V. ............................................................................................. 40

Figura 20 - Fonte de alimentação Ajustável nos valores: ±63, ±127, ±191, ±254 e ±325 V........................... 41

Figura 21 - Placa PCI 6251 utilizada no sistema de geração e aquisição dos sinais........................................ 41

Figura 22 - Diagrama de blocos do programa de geração e aquisição dos sinais para o eletropermeabilizador

® em LabVIEW ........................................................................................................................................ 42

  

Figura 23 - Transdutor de Tensão com divisor resistivo e amplificador de instrumentação INA 111BP. ...... 44

Figura 24 - Transdutor de Corrente por Efeito Hall LTSP 25-NP e amplificador de instrumentação

  INA111BP. ............................................................................................................................................ 45

Figura 25 - Sistema de Eletropermeabilização contendo amplificador, fontes de alimentação, transdutores e

® sistema de geração e aquisição de sinais desenvolvidos em ambiente LabVIEW para uma placa PCI- 6251. ...................................................................................................................................................... 45

Figura 26 - Tela do usuário do aplicativo Gerador de Sinais 1.0 .................................................................... 46

  

Figura 27 - Concatenação de três formas de onda, e apresentação da tela do usuário..................................... 47

Figura 28 - Pulso de onda quadrada com razão cíclica de 10%....................................................................... 48

Figura 29 - Implementação de forma de onda com fórmula matemática. ....................................................... 49

Figura 30 - Pulso retangular de 50!s aplicado em uma carga resistiva de 205,59 . V em amarelo e V em e s vermelho. ............................................................................................................................................... 50

  

Figura 31 - Tempo de subida para pulso retangular de 50 !s. V e em amarelo e V s em vermelho................... 50

Figura 32 - Tempo de descida para pulso retangular de 50 !s. V em amarelo e V em vermelho. ................ 51

e s Figura 33 - Resposta em freqüência do amplificador obtida pela análise de Fourier com onda quadrada de

  1Hz......................................................................................................................................................... 52 Figura 34 - Resposta em freqüência do amplificador obtida pela análise de Fourier com onda quadrada de 1kHz....................................................................................................................................................... 53

Figura 35 - Verificação da Estabilidade Térmica do Amplificador de tensão................................................. 54

  

Figura 36 - Curva de resposta do transdutor de tensão.................................................................................... 55

Figura 37 - Curva de resposta do transdutor de corrente. Curva em cor preta para freqüência de 1 kHz e curva

em vermelho para freqüência de 10 kHz................................................................................................ 56

Figura 38 - Sistema de Eletrodos utilizado nos experimentos......................................................................... 57

  Figura 41 - Comportamento da tensão e corrente na carga durante a aplicação do pulso de eletropermeabilização. ........................................................................................................................... 59

Figura 42 - Comportamento da Condutividade da amostra............................................................................. 60

  LISTA DE TABELAS

  

Tabela 1 - Quadro Comparativo entre eletropermeabilizadores (Modificado de Puc et al, 2004). ................. 26

Tabela 2 - Equipamentos comercialmente produzidos (Modificado de Puc et al, 2004), onde BT é baixa tensão, AT é alta tensão e NA é sem descrição...................................................................................... 27

Tabela 3 - Características dos transistores....................................................................................................... 32

  

Tabela 4 - Potência dissipada nos transistores principais ................................................................................ 35

Tabela 5 - Temperatura de junção máxima ..................................................................................................... 36

1 INTRODUđấO

  Eletropermeabilização é o fenômeno do aumento transitório da permeabilidade da membrana plasmática de células submetidas a campos elétricos intensos [Puc et al, 2004]. Estudos preliminares da eletropermeabilização datam de meados da década de 1950, e atualmente estão sendo pesquisadas aplicações em vários campos da biologia e medicina. As principais terapias e técnicas da aplicação de eletropermeabilização nestes campos estão sendo desenvolvidas em eletroquimioterapia, transferência genética, eletrofusão, eletroesterilização e administração de medicamentos via transdérmica. Apesar de o fenômeno ser conhecido há várias décadas, ainda não existe uma teoria definitiva para explicar conclusivamente os mecanismos físicos envolvidos na eletropermeabilização e eletrofusão de células.

  No estudo da eletropermeabilização são necessários equipamentos especialmente projetados para gerar campos elétricos intensos. Estes equipamentos são denominados de eletropermeabilizadores. Existem diversos modelos de eletropermeabilizadores disponíveis atualmente no mercado. Eles se distinguem principalmente no modo de geração do sinal de estimulação e no controle de suas características (forma de onda, freqüência, amplitude e duração).

  1.1 OBJETIVOS

  Neste contexto, a proposta deste trabalho é o desenvolvimento de um sistema eletrônico ou eletropermeabilizador, incluindo construção e teste, com as características adequadas para a realização de pesquisas de caracterização da eletropermeabilização in vitro de suspensões de células e tecidos biológicos.

  O desenvolvimento deste projeto envolve amplificadores de alta tensão, fontes de alimentação, circuitos de sensoriamento de tensão e corrente na carga e interfaces com o sistema de geração e aquisição de sinais que comanda o eletropermeabilizador.

  A proposta detalhada deste trabalho será apresentada no capítulo seguinte após uma revisão dos modelos de eletropermeabilizadores e técnicas de eletropermeabilização, tendo assim um melhor entendimento do projeto a ser desenvolvido.

  1.2 ESTRUTURA DO TRABALHO

  Para o entendimento do projeto proposto, este trabalho está organizado em quatro capítulos, descrito sucintamente a seguir. O Capítulo 2 apresenta a revisão bibliográfica necessária como base para o entendimento do projeto do eletropermeabilizador. Sendo assim, abordam as técnicas e aplicações mais conhecidas da eletropermeabilização, os eletropermeabilizadores comercialmente produzidos, descrevendo os modelos de forma sucinta, e ao final deste capítulo apresenta as características desejadas do equipamento que foi desenvolvido neste projeto.

  O Capítulo 3 apresenta o desenvolvimento do projeto do eletropermeabilizador, dividido em amplificador, fontes de alimentação, sistema de sensoriamento e por fim o gerador de forma de onda arbitrária, necessário para o desenvolvimento da pesquisa em eletropermeabilização.

  No capítulo 4 são apresentados os resultados obtidos experimentalmente que comprovam o correto funcionamento do sistema, bem como alguns resultados experimentais da eletropermeabilização de células de rato em suspensão eletrolítica.

  Por fim, o Capítulo 5 apresenta as conclusões deste trabalho e as propostas para trabalhos futuros.

2 ELETROPERMEABILIZAđấO E ELETROPERMEABILIZADORES

  A ruptura elétrica reversível da membrana celular por pulsos elétricos foi primeiro relatado por Stampfli em 1958, mas por algum tempo este trabalho passou despercebido. Aproximadamente uma década mais tarde, Sale e Hamilton relatam à destruição de microrganismos utilizando pulsos elétricos intensos [Miklav i e Puc, 2006]. Em 1972, Neumann e Rosenheck relatam que pulsos elétricos induzem um grande aumento da permeabilidade da membrana em vesículas [Neumann e Rosenheck, 1972]. Estes estudos pioneiros motivaram uma série de novas investigações. Em 1982, Neumann, Ridder, Wang e Hofschneider, relatam que os genes do DNA podem ser transferidos para as células usando pulsos elétricos com formato exponencial [Neumann et al, 1982]. Poucos anos mais tarde, em 1987, Okino e Mohri, relatam que substâncias (sacarose, marcadores e íons) podem ser introduzidas em células vivas. E esta técnica pode ser utilizada para o aumento da citotoxicidade da bleomicina (droga quimioterápica), em condições in vivo e in vitro, utilizando pulsos elétricos [Okino e Mohri, 1987]. A partir deste tempo, os dados começaram a acumular-se mais rapidamente e sistematicamente. A maior parte dos trabalhos iniciais foi feita sobre células em condições in vitro, mas muitas aplicações são igualmente bem sucedidas na situação in vivo.

  O estudo da eletropermeabilização e eletrofusão, nestas últimas décadas tem sido amplamente pesquisado em vários campos da biologia, bioquímica, oncologia e medicina. As suas aplicações são as mais diversas como, por exemplo: a transferência de plasmídeos (DNA) em plantas e animais [André et al, 2008] no aumento da eficiência das vacinas contra o câncer [Scott-Taylor et al, 2000], na eletroquimioterapia com a transferência de quimioterápicos para dentro das células tratando tumores de forma mais eficiente [Serša et

  

al , 2008] na tecnologia embrionária [Ferber, 2001], pesquisa agrícola [Uemura e Isobe,

  2002], entre outros. Estes estudos que envolveram a utilização da eletropermeabilização e a eletrofusão tem crescido exponencialmente desde meados de 1980, contudo, apesar de conhecidos há várias décadas ainda não existe uma teoria definitiva para explicar conclusivamente os mecanismos físicos envolvidos.

2.1 ELETROPERMEABILIZAđấO

  A utilização da técnica da aplicação de pulsos elétricos de alta tensão em células e tecidos biológicos, conhecida como eletropermeabilização, tem despertado grande interesse desde os primeiros relatos publicados há várias décadas [Neumann e Rosenheck, 1972]. Eletropermeabilização é um fenômeno transitório que aumenta a permeabilidade da membrana plasmática celular. No estado de alta permeabilidade, a membrana plasmática permite a passagem de íons e moléculas que no estado normal da célula encontram grande obstáculo para atravessar a membrana. Além da introdução de diferentes substâncias para o citoplasma, a permeabilização da membrana celular permite a fusão celular ou inserção de proteínas na membrana celular, conforme mostra a Figura 1 [Puc et al, 2004]. Figura 1 - Efeitos da exposição de células a um campo elétrico intenso. Modificado de Puc et al, 2004.

  A eficácia da eletropermeabilização e suas aplicações dependem fortemente de parâmetros que podem ser divididos em campo elétrico (amplitude, duração, freqüência, repetição, número de pulsos e forma de pulso) [Rols e Tessie, 1998; Pavlin et al, 2008] e as características que definem o estado das células e as suas imediações (temperatura, pressão osmótica, tamanho e forma de células, etc) [Tessié et al, 1999]. Com os valores corretamente escolhidos dos parâmetros de campo elétrico, o processo de eletropermeabilização é reversível e a célula retorna ao seu estado fisiológico normal. Este processo pode demorar de minutos a horas. Se esses parâmetros ultrapassam certos limites (exemplo, amplitude dos pulsos demasiadamente alta ou duração do pulso muito longo), as células são irreversivelmente permeabilizadas e morrem (morte celular) [Tessié et al, 2008]. A permeabilização da membrana plasmática é atingida pela exposição da célula a um campo elétrico intenso de curta duração. A quantidade necessária a este processo é a diferença do potencial transmembrana induzida, o qual em primeira aproximação é proporcional ao produto da intensidade do campo elétrico aplicado com o raio da célula de acordo com a equação (2.1) e ilustrado pela Figura 2.

  " t # $ 1,5. . .cos 1 exp( ) (2.1)

  V % a E " m & ! '

  onde V é o potencial transmembrana induzido, a é o raio da célula, E é o campo elétrico

  m

  uniforme aplicado, ! é o ângulo entre o vetor campo elétrico e o vetor posição da membrana, t é o tempo em segundos, e " é a constante de tempo de carregamento da membrana.

  

E o

a h Onde, Eo é o campo elétrico aplicado; ! o ângulo entre a direção do campo elétrico e o vetor de posição na membrana.

  Esta equação é correta apenas para células esféricas de raio muito maior que a espessura da membrana, em um campo elétrico uniforme e em um meio de alta condutividade, tal que, a corrente de deslocamento no eletrólito adjacente à membrana seja desprezível comparado à corrente de condução. O potencial transmembrana varia cossenoidalmente com o ângulo de incidência do campo na membrana. Quando o potencial alcança um valor limiar entre 0,2 a 0,5 Volts, ocorre a eletropermeabilização [Pucihar et al, 2006]. A intensidade do campo aplicado determina a área da membrana afetada pela eletropermeabilização, bem como a variação da condutância da membrana nesta região. Uma vez que o potencial transmembrana depende também do raio da célula, as células grandes são mais sensíveis ao campo que as células pequenas, ou seja, o campo elétrico deve ser mais intenso para células menores [Tessie et al, 1999]. Além disso, o potencial transmembrana induzido depende também da densidade de células e da disposição das células no volume da amostra, bem como da forma de onda, freqüência, intensidade e duração do campo elétrico. Ocorre que na eletropermeabilização a permeabilidade da membrana é aumentada pelo surgimento de poros não seletivos na matriz lipídica, os quais apresentam uma dinâmica própria de abertura e fechamento. Somando-se a isso o fato do potencial transmembrana apresentar uma dependência com a freqüência típica de um sistema de primeira ordem, conclui-se que o espectro de freqüências do campo aplicado tem importância fundamental no processo.

2.2 TERAPIAS E TÉCNICAS DE APLICAđấO DA ELETROPERMEABILIZAđấO

  Atualmente, a eletropermeabilização é principalmente utilizada na pesquisa em biologia celular, eletroquimioterapia de tumores e biotecnologia [Serša et al, 2006]. Em todas essas aplicações deseja-se que as células retornem ao estado normal depois da abertura de poros devido à aplicação do estímulo elétrico, ou seja, deseja-se que o processo seja reversível. Por outro lado, existem aplicações nas quais se deseja a morte celular, ou seja, a eletropermeabilização deve ser irreversível. Este é o caso da aplicação em tratamento da água e esterilização de alimentos, por exemplo.

2.2.1 Eletroquimioterapia

  Este processo consiste na aplicação do campo elétrico para permeabilizar as membranas plasmáticas de células de um tecido cancerígeno, possibilitando a inserção de drogas quimioterápicas localmente sobre a área lesada, diminuindo a citotoxidade do tratamento do câncer e aumentando a sua eficácia. Em 1987, Okino e Mohri, quando realizaram os primeiros experimentos in vivo, aplicaram um campo elétrico com pulso exponencial decrescente de 5000 V/cm em um tumor e administrado bleomicina (droga quimioterápica), obtiveram com este tratamento combinado uma redução de 17% da massa inicial do tumor após quatro dias [Okino e Mohri, 1987]. Seguindo a mesma sistemática, mas com aplicação in vitro, têm-se os experimentos realizados por Mir et al, foi aplicado oito pulsos de onda quadrada de 100 #s e freqüência de 1 Hz e variando a intensidade do campo elétrico de O a 2000 V/cm [Mir et al, 1988]. Os resultados mostraram que o aumento da intensidade do campo elétrico aumenta a absorção das moléculas, mas também técnica, tais como a melhoria na distribuição do campo elétrico nos tecidos com a alteração do posicionamento, orientação e formato dos eletrodos [Sers$ et al, 1996; Župani et al, 2007].

  2.2.2 Eletrotransferência ou Transferência genética

  Um dos primeiros relatos de transferência genética foi publicado em 1982 [Neumann et al, 1982]. Com experimentos in vitro os autores transferiram genes de ratos utilizando células lyoma com a aplicação de um pulso de campo elétrico exponencial decrescente na ordem de 8000 V/cm. Este processo não-viral de transferência genética foi denominado de eletrotransferência. Nos estudos seguintes de eletrotransferência, diferentes formas de onda e intensidades de campo elétrico foram testadas. A eletrotransfrência in

  

vitro pode ser obtida utilizando pulsos exponenciais decompostos, pulsos de onda quadrada

  de curta duração sobrepostos [Chang et al, 1982], pulsos de onda quadrada de longa duração de até 20 ms e com amplitudes de até 800 V/cm [Wolf et al, 1994]. Nos primeiros estudos in vivo da eletrotransferência, com pulsos de onda quadrada de longa duração foram utilizados pulsos de vários milissegundos com amplitudes de até 300 V/cm na eletrotransferência em músculo esquelético [Mir et al, 1999] e de 400 a 600V/cm na eletrotransferência em tumores [Bettan et al, 2000]. Outra abordagem recente é a combinação de pulsos de alta e pulsos de baixa tensão para o tratamento. O novo método baseia-se na aplicação de vários pulsos curtos de alta tensão (exemplo, 8 pulsos de 100 #s com 1300 V/cm), que são seguidos por pulsos longos de baixa tensão (exemplo, 1 pulso de 100 ms com 100 V/cm) [S$tkauskas et al, 2002]. Este conceito sugere que pulsos curtos de alta tensão permeabilizam a membrana celular enquanto que os pulsos de baixa tensão têm efeitos eletroforéticos sobre o DNA, facilitando a interação do plasmídeo com a membrana celular.

  2.2.3 Eletroinserção

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